乌苯美司对肾癌细胞体外生长的影响及机制的研究

www.Vinisiren.com_【官方首页】-澳门威尼斯人原创性声明IIIIIIlllllllllqqlllllllqqllllll qlllllqlllllI Y2598484 本人郑重声明:所呈交的学位论文,是本人在导师的指导下,独 立进行研究所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外,本论文不 包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的科研成果。对本文的研 究作出重要贡献的个人和集体,均已在文中以明确方式标明。本声明 的法律责任由本人承担。 论文作者签名: 日期:丝!生!丝关于学位论文使用授权的声明 本人完全了解山东大学有关保留、使用学位论文的规定,同意学 校保留或向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版,允许论 文被查阅和借阅;本人授权山东大学可以将本学位论文的全部或部分 内容编入有关数据库进行检索,可以采用影印、缩印或其他复制手段 保存论文和汇编本学位论文。 (保密论文在解密后应遵守此规定) 论文作者签名:盔垫 导师签名:垒!多 日期:垫吐丝 山东大学硕士学位论文 l356826451012233455录~~一~~~~~~~~~目~~~~~一~一一~~~丈~一~一~一一~~一~仑~一~一~一~~~~~术 山东大学硕士学位论文CONTENTS Chinese abstract…………………………………………………………………………………………..1 Engl ish abstract…………………………………………………………………………………………..3 Li st abbreviations………………………………………………………………………………….5Introduction………………………………………………………………………………………………….6 Material sand Methods………………………………………………………………………………….8 Resul t…………………………………………………………………………………………………………..22 Di scussion……………………………………………………………………………………………………26 Conclusion……………………………………………………………………………………………………34 Appendix figures…………………………………………………………………………………………35 References……………………………………………………………………………………………………4l Acknowledgements…………………………………………………………………………………………50 Li st published papers…………………………………………………………………………..51 山东大学硕士学位论文 乌苯美司对肾癌细胞体外生长的影响及机制的研究 硕士研究生:解放 导师:牛志宏 中文摘要 目的研究乌苯美司对肾癌细胞株786-0和OS-RC一2体外生长的影响,初步 研究其对肾癌细胞作用的机制。 方法1.以肾癌细胞株786-0及0S—RC-2为研究对象研究乌苯美司对肾癌细 胞体外生长的影响:WST-8细胞增殖实验及细胞生长曲线绘制检测乌苯美司对肾 癌细胞株786-0细胞及OS-RC-2细胞增殖能力的影响;细胞划痕实验观察乌苯美 司对肾癌细胞株786-0细胞及OS-RC-2细胞迁移能力的影响;Transwell细胞侵 袭实验观察乌苯美司对肾癌细胞株786—0细胞及OS—RC一2细胞侵袭能力的影响。 2.乌苯美司对。肾癌细胞株786-0和0S—RC一2作用机制的初步研究:L一亮氨酸一P 硝基苯胺底物法检测乌苯美司对肾癌细胞株786—0细胞及OS—RC一2细胞氨肽酶活 性的影响。www.Vinisiren.com_【官方首页】-澳门威尼斯人Western Blot检测乌苯美司作用于肾癌细胞株786—0细胞及0S—RC一2 细胞后,两种细胞CDl3、LC-3、Caspase一3的表达水平。以不同浓度的乌苯美司、 自噬诱导剂rapamycin、自噬抑制剂3-Methyladenine作用于。肾癌细胞株786—0 和OS-RC-2,LDH释放试验检测作用后细胞的死亡率。3.以肾癌患者手术取得病 理组织为研究对象:Western Blot检测氨肽酶N/CDl3和LC一3在肾癌组织和癌 旁正常组织的表达量;以肾癌患者及肾良性病变患者手术取得病理组织构建肾脏 病变的组织芯片,通过免疫组化染色观察乌苯美司的作用靶点氨肽酶N/CDl3在 肾癌组织及正常组织中的表达情况。 结果WST一8细胞增殖检测及细胞生长曲线显示经0.1mg/ml乌苯美司作用 后,肾癌细胞株786-0及OS-RC-2增殖均受到明显抑制(P<O.05),且随着药物 浓度的增加,这种抑制作用也逐渐增强(P<O.05)。细胞迁移实验结果表明 0.5mg/ml乌苯美司作用12小时对肾癌细胞株786—0及OS—RC一2细胞的迁移有明 显的抑制作用(P<O.05),且随着乌苯美司药物浓度增加,抑制作用也随之增强 (Jp<0.05)。Transwell细胞侵袭实验结果显示0.5mg/ml乌苯美司作用24小时 能明显抑制786-0及OS-RC-2细胞的侵袭(P<0.05)。氨肽酶活性检测试验证实 山东大学硕士学位论文经0.25mg/ml乌苯美司作用24小时后,肾癌细胞株786-0及OS-RC-2细胞的氨 肽酶活性都明显降低活性(P<0.05)。www.Vinisiren.com_【官方首页】-澳门威尼斯人Western Blot结果显示最高浓度为 0.5mg/ml乌苯美司作用于肾癌细胞株786—0及OS-RC一2后,并没有降低两种细 胞氨肽酶N/CDl3蛋白的表达量(P>O.05);两种肾癌细胞株的自噬相关蛋白 LC一3B表达量明显升高(P<O.05),且这种效应可被自噬诱导剂Rapamycin增强 或被自噬抑制剂3一MA阻断(P<0.05)。对手术病理组织的Western Blot检测结 果显示氨肽酶N/CDl3和LC一3在肾癌组织及癌旁正常组织中均有表达,且2种蛋 白在癌旁正常组织中的表达量均明显高于癌组织(P<O.05)。肾脏组织芯片免疫 组化染色显示氨肽酶N/CDl3在各种病理类型的肾脏病变中均有表达,且在不同 病理类型和分级分期中无明显差异(胗O.05)。 结论1.乌苯美司对肾癌细胞的增殖、迁移、侵袭有抑制作用。2.其机制与 抑制氨肽酶N活性有关;乌苯美司作用后两种肾癌细胞株的自噬相关蛋白LC一3B 表达量都明显升高。乌苯美司对785-0细胞系中的细胞毒性作用可被自噬诱导剂 Rapamycin增强或倍自噬抑制剂3一MA阻断(P<O.05),提示其可能通过诱导细 胞自噬发挥抗肿瘤效应。www.Vinisiren.com_【官方首页】-澳门威尼斯人 【关键词】肾癌;CDl3;乌苯美司:自噬 山东大学硕士学位论文 Funct ion Mechanism Ubenimex inHuman Rena IIlIlICe lI Carc inoma Ce II Lines inVitro Postgraduate:Xie Fang Tutor:Niu Zhihong ABSTRACT Objective To study humanrenal cell carcinoma cell lines 786.O OS.RC.2.Methods 1.The renal cell carcinoma cell lines 786.O ubenimex.Themethods follows:CellWas cultured differentconcentration.WST-8 cell proliferation assay cellgrowth curve cellproliferation.111e scratch motility assay Was used describerenal cell carcinoma cell 786一O movement.Matrigelinvasion assay Was used invasionability renalcell carcinoma cell 786.O OS.RC.2.2.Themechanism roecells.The activity renalcell carcinoma cell lines 786 OS-RC一2Was detected CDl3胎—N,that alanine-p—nitroanilido.111eCD 13/aminopeptidaseN(APN),Caspase3,LC-3B protein expression renalcell carcinoma cell 786.O OS—RC.2after treated differentconcentration westernblot analysis.3.nle pathological kidney tissue Was collected from patients witll malignant benignrenal tumor.Western blot analysis Was used CDl3/A卧Iexpression renalcarcinoma tissue anS adjacent normal tissue eachpatient.The kidney tissue micro-array Was constructed expressionintensity CD13/APN differentlesion immunohistochemistry.Results 111e cell growth curve WST-8assay demonstrated 0.1mg/ml ubenimex could significantly inhibit growth renalcarcinoma cell lines 786-O ubenimexincreased,the inhibiting effect become more apparent(P<0.05).Scratch wound-healing migration assay showed 0.5mg/mlubenimex could inhibit renalcarcinoma 山东大学硕士学位论文cell lines 786一O moresignificant drugconcentration increased.APN activity assay shows 0.25mg/mlubenimex could decrease APN activity OSRC一2 cell line(P<0.05).The westem blot analysis showed ubenimexhad CD13/APN expression OS—RC一2cell line伊>O.05).The expression LC-3BWas up regulated after treated 谢th ubenimex,which could rapamycin.TheCDl 3/APN expression renalcarcinoma tissue Was higher than adjacentnormal tissue eachpatient westemblot analysis(P<0.05).Immunohistochemistry shows CD13/APN expression had relationshipwitll tumor grade stage(P>O.05). Conclusion 1.ubenemex Can inhibit renalcarcinoma cell lines 786-O vivo.2.Themechanism maybe related aminopeptidaseNactivity.The cytotoxicity ubenimexCan 3-methyladenine,whichindicated antitumoractivity maybe related itseffect autophagy.[Key words]renal cell carcinoma;CDl3;ubenimex;autophagy 山东大学硕士学位论文符号说明 缩写词 英文全称 中文全称 RCC renal cel 1carc inoma 肾细胞癌 AJCC American Joint Committee Cancer美国癌症联合委员会 HE Hematoxyl in——eosin 苏木素一伊红 PBS Phosphate Buffer Solut ion 磷酸盐缓冲液 RIPA Radio Immunoprecipitation Assay 放射免疫沉淀实验 APN Aminopeptidase N氨肽酶N NGR asparagin—’glycine。www.Vinisiren.com_【官方首页】-澳门威尼斯人。arginine peptide 天冬氨酸一甘氨酸一精氨 3一MA3-Methyladenine 3一甲基腺嘌呤 VEGF Vascular endothel ial growth factor 血管内皮生长因子 HIF Hypox iainduced factor 缺氧诱导因子 VHL gene von Hippel——Lindau gene L基因 P13K phosphoinositide一3 kinase 磷脂酰肌醇3激酶 PDK phosphoinositide dependent kinase 磷脂酰肌醇依赖的激酶 PTEN phosphatase tensinhomolog 10号同源染色体缺失的 deleted chromosometen 磷酸酶和张力蛋白基因 肾癌是泌尿系统常见的恶性肿瘤,占全身恶性肿瘤的3%,而且其发病率呈逐年增加的趋势。www.Vinisiren.com_【官方首页】-澳门威尼斯人虽然近年随着医疗水平的提高,肾癌早期发现率逐渐有增高,手 术治疗早期肾癌效果良好,但肾癌的致死率仍然很高。究其原因主要是由于常规 的辅助治疗方法如放疗、化疗对肾癌不敏感,难以为手术治疗后的进展期肾癌患 者提供有效的后续治疗,仅能部分缓解晚期肾癌患者的临床症状。www.Vinisiren.com_【官方首页】-澳门威尼斯人肾癌是一种与 免疫相关的肿瘤,目前主要依靠细胞因子治疗、分子靶向治疗作为一线方案【M】, 但总的有效率仍然较低。www.Vinisiren.com_【官方首页】-澳门威尼斯人此外还有过继性免疫治疗、自体肿瘤疫苗等治疗方法, 但尚处于实验阶段,急需更加有效的治疗方法应用于肾癌的辅助治疗。 乌苯美司(Ubenimex)是一种小分子肽,最初由橄榄网状链霉菌培养液中分离得 到,最初在1975年由日本学者梅泽滨夫从橄榄网状链霉菌培养液中分离得到, 并在1976年由日本学者采用以苯丙氨酸为起始原料完成了人工化学合成。1987 年该药作为一种抗肿瘤药物在日本上市,商品名Bestatin。作为一种免疫调节 剂,已被应用于急性髓性白血病131、非小细胞肺癌肺癌阳】、胃癌【71、膀胱癌【8】等 恶性肿瘤的临床试验和治疗,取得了一定的效果,但乌苯美司在肾癌治疗中作用 的研究却很少。现有的研究显示乌苯美司可通过抑制细胞表面氨肽酶活性和调节 免疫肾癌起到抗肿瘤的作用,但具体的抗肿瘤机制仍然不明确。现有的研究发现 氨肽酶N(Aminopeptidase N,APN)是乌苯美司作用的主要靶点之一。氨肽酶N又 称CDl3,全长为967个氨基酸,氨基端有一段较短的胞浆结构域,此外还有一个 跨膜部分和一个带有活性位点的胞外结构域,能降解氨基端为中性氨基酸的蛋白 或肽[9-10i。是氨肽酶类中的一种。氨肽酶能降解细胞外基质、调节趋化因子活性、 释放细胞因子及受体、粘附分子,从而调控细胞的生长、迁移、等活动【ll】。氨肽 酶N除上述作用外,还与肿瘤血管、肿瘤细胞及肿瘤干细胞之间关系密切,其在 肿瘤新生血管内皮细胞中特异表达并与肿瘤血管的形成密切相关,是肿瘤抗血管 治疗的重要靶点f12.13】。此外氨肽酶N还有抗原呈递、病毒受体等作用【14】。氨肽酶 N与肿瘤血管、肿瘤细胞及肿瘤干细胞之间关系密切,其在肿瘤新生血管内皮细 胞中特异表达并与肿瘤血管的形成密切相关。但肾癌组织中氨肽酶N表达量低于 正常肾组织,因此乌苯美司应用于肾癌治疗的研究很少。2003年Sugano 报道一例工V期肾癌患者在术后4个月开始服用乌苯美司,五年内未在发生转移山东大学硕士学位论文 5】。这提示乌苯美司对肾癌治疗有潜在价值,可能通过调节免疫等其它机制影响肾癌细胞的生长。因此本实验应用乌苯美司作用于肾癌细胞,验证乌苯美司是否 有治疗肾癌的作用。通过观察乌苯美司对肾癌细胞的增殖、迁移、侵袭等行为的 影响及相关蛋白表达水平的变化,为其在肾癌患者的临床应用提供理论基础,探 讨将其对于肾癌患者尤其是进展期肾癌患者临床辅助治疗的应用价值。 山东大学硕士学位论文 材料与方法 一、实验材料 (一)肾透明细胞癌细胞株 (1)786-0肾癌细胞株:购自中科院细胞库,为人源的原发性透明细胞癌细胞 株。是一种有微绒毛和桥粒并且能在软琼脂是生长的细胞。 具有与乳腺癌和肺 癌中相似的PTH样多肽。这种多肽的N端与PTH相似,并具有与PTH相似的活性。 (2)OS—RC-2肾癌细胞株:购自中科院细胞库,为来源于日本人的肾癌细胞。 细胞表面具有微绒毛,胞浆内含有糖原颗粒。核型分析表明这种细胞株中有小部 分细胞表现为40条染色体的亚二倍体,并有一部分表现为75条染色体的亚四倍 体。这种细胞可以移植到裸鼠,细胞形态为上皮样细胞。 (二)组织标本 (1)Western Blot组织标本 Western Blot组织标本取自2013年12月-2014年1月山东大学附属省立 医院泌尿外科进行手术患者术中取得病理标本。收集患者标本4人,均为肾透明 细胞癌,具体资料如下。 (2)构建组织芯片组织标本 、构建组织芯片组织标均来自山东大学附属省立医院泌尿外科2012年6月至 2013年3月间行手术治疗的肾癌患者。所有病理标本均经4%多聚甲醛固定、石 蜡包埋、HE染色后由病理科医师确诊为肾细胞癌。取上述肾癌标本构建组织芯 病人基本信息及分级分期资料:收入患者男39人,女24人,年龄20岁-77岁,平均年龄52.1岁,中位年龄52岁。4例患者伴有肾囊肿,3例患者伴有肝 囊肿,2例伴有肾上腺结节样增生,1例伴有肾上腺皮质腺瘤。病理分级根据1982 年Fuhrman四级分类,分期根据2009年AJCC的TNM分期系统,由病理科医师根 据病理切片表现及临床数据判定。病理结果显示透明细胞癌55例,其中I级5 山东大学硕士学位论文例、II级46例、级3例、级1例;乳头状肾癌6例;透明细胞癌合并颗粒 细胞癌2例;透明细胞癌合并乳头状肾癌1例;透明细胞癌合并嗜酸细胞癌1 例;混合细胞癌1例;嫌色细胞癌1例。患者具体临床资料见下表。 构建组织信息的患者临床资料木 No.性别年龄分级分期病理类型 No.性别年龄分级分期病理类型 1f57 23C35 m55 13C34 f49 21C冰性别f:女性;m:男性。病理类型C:透明细胞癌;p:乳头状肾癌;mix:混合细 胞癌;c+g:透明细胞癌合并颗粒细胞癌;c+o:透明细胞癌合并嗜酸细胞癌;cp: 嫌色细胞癌。 9)OpCCC耳C CC+ CCCCC+ CCCpCCCCCCCCCCCCCp(CC3123133l221l1331l33l111111112l12222122222222222222222222222223126767OOO414089207057699725O95l175465444645534365447546534556362mmfmmmmmmmmmmmmmfmfmfmmffmmmmmmf6789O123456789O1234567890l23456733334444444444555555555566666666pXgCCCCpCCCC+ C.1+ CCCCCCpCpCCpCCCCCCCCmC12133331l321242113312131323331l2口。口o cvu 2232l2212~ 142222222—222222222204346642587789476299837Ol546178257654655553235675563435245575746mmmfmmfmffmmffmmmfmmmfmffffmffmf23456789加n挖坞M坫M懈均加殂毖捣丛沥拍打嬲凹趴弛 山东大学硕士学位论文 二、主要实验仪器 实验仪器: HERA cell 240i恒温孵箱、GmbH D-37520低温离心机、1510酶标仪为芬兰 Thermo公司产品。IMT-2倒置相差显微镜为日本Olympus公司产品。DFC480正 置显微镜为德国徕卡公司产品。MDF-U53V-80"C超低温冰箱为日本SANYO公司产 品。YDS一50B一80液氮储存罐购自中国成都液氮容器厂。BC一185GE 4冰箱为中 国益友公司产品。Mini spin plus小离心机为Eppendorf公司产品。powerpac 300 电泳仪为美国Biorad公司产品。Las4000mini凝胶成像仪为日本FUJIFILM公司 产品。 实验耗材: (1)细胞培养: 1.2ml冻存管(Costar,USA),25cm2培养瓶 (Corning,USA),50ml无菌离心管(Costar,USA),15ml无菌离心管(Costar),6 孔细胞培养板(Costar),24孔细胞培养板(Costar),96孔细胞培养板(Costar), lOOmm培养皿(Costar) (2)Western Blot:PVDF膜(0.45 um,0.2 um,Millipore)、电泳玻璃板 (Biorad)、梳子(Biorad)、灌胶架(Biorad)、转膜夹(Biorad)、滤纸。 (3)免疫组化:22X22mm盖玻片/厚度0.13mm-O.17mm(Zuanshi,China)。 三、主要试剂 (一)乌苯美司(Ubenimex):又名AL[(2S 3励-3-氨基-2-羟基一4一苯丁酰卜L一 亮氨酸,最初由日本学者在1976年从橄榄网状链霉菌培养液中分离得到。目前被 认为是一种氨肽酶抑制剂,具有抗肿瘤和免疫调节作用,已经证实对急性白血病、 肝癌、胃癌、肺癌、鼻咽癌等恶性肿瘤有明显的治疗作用。本实验使用的乌苯美 司原料药由深圳万乐药业惠赠,批号H20090287。原料药干粉分装后CC保存,使 用时溶解在无菌DMSO(302A0310,Solarbio)中后加入培养基。 (二)主要抗体:兔抗人CDl3单克隆抗体(abl08310,Abcam,USA),兔抗人LC一3B 单克隆抗体(AL-221,Beyotime,China),兔抗人Caspase一3多克隆抗体 (AJll31A,abgent,USA),小鼠抗人GAPDH多克隆抗体(TA一08,Zsbio,China), 辣根过氧化物酶标记的抗小鼠多克隆抗体(ZB2305,Zsbio,China)和辣根过氧 化物酶标记的抗兔多克隆抗体(ZB2301). 1n 山东大学硕士学位论文 (三)其它试剂 (1)细胞培养主要试剂:改良型RPMll640培养基(HyClone,USA),胎牛血清 (Gibco,USA),lOOU/ml青霉素及100 la g/ml链霉素(Hyclone),1 XPBS缓冲液 (Hyclone),胰酶一EDTA(Hyclone)。 (2)WST-8细胞活力测定实验主要试剂:细胞增殖与毒性检测试剂盒(Cell Counting Kit,7sea,China)。WST一8类似于MTT,可以在电子耦合剂卜甲氧基PMS 存在的条件下被还原成WST-8甲躜。而提供电子的NADH贝U是由细胞内脱氢酶参与 的反应生成。因此该实验反映了细胞内脱氢酶的活性。 (3)Transwell细胞侵袭实验主要试剂:基质胶/Matrigel(BD,Bioscience, USA),Transwelld室(3422,8 um孑L径,Costar,USA)。 (4)酶活性底物法测定CDl3/APN活性主要试剂:L一亮氨酸一P硝基苯胺 /L—alanine—P—nitroanilido(1mmol/L,Sigma,USA)。 (5)Western Blot主要试剂:BCA蛋白浓度测定试剂盒(POOl2,Beyotime,China), 蛋白上样缓冲液(POOl5,Beyotime,China),一抗稀释液(P0023A, Beyotime),SDS(N163501,Bio—rad,USA),甘氨酸(110247,Bio—rad)TriS(110264, Bio—rad),30%聚丙烯酰胺(丙烯酰胺:亚甲双丙烯酰胺29:l,AIOIO一500, Solarbio,China),RIPA裂解液(合"PMSF lml/支,现用现配,R0020,Solarbio), 预染蛋白质梯/lO一170(26616,Thermo,USA)。 (6)LDH细胞毒性实验主要试剂:乳酸脱氢酶细胞毒性检测试剂盒(C0017, Beyotime,China)。该实验是基于硫辛酰胺脱氢酶(Diaphorase)催化的将INT 还原成甲躜的反应。反应中提供电子的NADH来自乳酸脱氢酶催化的乳酸氧化成丙 酮酸的反应,因此可反映出培养液中LDH的活性。该试剂盒包括LDH释放试剂、乳 酸溶液、酶溶液、INT溶液(10X)、INT稀释液。使用时需先将INT溶液(IOX)用INT 稀释液稀释10倍制成1 XINT溶液,再将乳酸溶液、INT溶液(1 X)、酶溶液按1:1:1 制成LDH检测到工作液,1 XINT溶液和LDH检测工作液需现用现配。 (7)肾癌组织芯片免疫组化染色:兔Streptavidin—HRP试剂盒(CW0118,Cwbio, China),该试剂盒包括内源性过氧化物酶封闭液、封闭用正常羊血清工作液、生 物素标记羊抗兔二抗工作液、HRP标记的链霉亲和素。抗原修复A液: 21.OlgC6H807 H20溶于1000ml蒸馏水:抗原修复B液:29.419 C6H。Na。0, 2H。0溶 山东大学硕士学位论文 于1000ml蒸馏水。1PBS:NaCl 189、NaHP04 12H:0 129、NaH。PO。 2H20 0.89 溶于2000ml蒸馏水。 四、实验方法 (一)细胞培养 (1)常规培养及细胞传代:786-0及OS-RC-2肾癌细胞株均培养在改良型 RPMll640培养基中,常规培养时加入了10%胎牛血清及1%青霉素和链霉素,构 成完全培养基。培养条件为37、5%C0:的恒温培养箱。正常情况下786—0及 0S—RC-2细胞均为贴壁生长。每天在倒置相差显微镜下观察细胞生长情况,一般 隔天换液一次。换液时先吸去培养瓶或培养皿中培养基,加PBS洗涤2次后再加 入完全培养基。细胞密度达到80—90%且细胞形态仍保持良好时进行传代,传代 周期一般为3天。细胞传代步骤如下:1)先弃去培养瓶内培养基,PBS洗2次; 2)培养瓶内加Iml胰蛋白酶-EDTA,37。C孵育约3分钟,倒置显微镜下观察细胞 变圆并脱落后,加入3ml完全培养基终止消化,并用吸管将成团的细胞吹散。3) 细胞悬液移至15ml离心管中,i000转/分离心5分钟,弃去上清,加入完全培 养基吹散细胞沉淀,分装到3个培养瓶中,置于37。C、5%C0:中继续培养。 (2)细胞冻存:细胞处于对数生长期,状态良好并且细胞密度达到80一90%冻存 细胞,步骤如下:1)配制细胞冻存液:将改良型RPMll640培养基、胎牛血清、 DMSO按7:2:1比例混合、震荡混匀。2)消化、离心细胞(具体见细胞传代步骤)。 3)离心后吸去上清液,加入冻存液并吹匀,调整细胞计数约l106/ml,移至1.2ml 冻存管中。在冻存管标记冻存日期及细胞株信息,用封口膜封口。置于4。C冰箱 30分钟,移至一20。冰箱2小时,再移至一80冰箱过夜,次日转入液氮中保存。 (3)细胞复苏:1)水浴锅预热到37准备。2)从-80冰箱或液氮中取出细 胞,迅速放入37。C的水浴锅中并摇动,使其内液体在卜2分钟内融化。3)将融 化后的细胞悬液移置15ml离心管中,1000转/分钟离心5分钟,离心后弃去上 清并加入完全培养基。4)将细胞置于37。C、5%C0。培养箱中培养,次日观察细 胞状态并换液。 (4)细胞计数:1)细胞消化,吹散制备细胞悬液,方法同细胞传代。用加样器 吸取20 u1悬液沿盖玻片边缘烧靠外侧滴加,使悬液由于气压影响均匀吸入计数 板与盖玻片之间,多余的悬液将流入计数板的凹槽中。2)倒置相差显微镜下观 山东大学硕士学位论文 察,健康活细胞呈规则圆形、透明状。计算计数板4个角的4大格内细胞数(格 子边线上的细胞只记上边、不计下边;只记左边、不记右边)。细胞密度=4大格 细胞总数0.25104/ml。 (二)细胞增殖曲线绘制 (1)当786—0及OS-RC-2细胞处于对数生长期,密度80—90%时,制备细胞悬液 并细胞计数,方法同上。调节细胞悬液浓度为1 X105/ml。 (2)接种细胞悬液lml接种于于24孔板上,然后再根据不同条件加药,保证每 孔细胞数基本一致。同一种细胞同一种加药条件设计计数6天,每天计数3个孔, 即每种条件需设置18个孔。 (3)将培养板置于37、5%C0。中培养。 (4)从接种次日开始计数,记为第1天(第0天细胞数记为接种细胞数,即1 105)。每孔加200 1.t l胰酶一EDTA,消化、吹散、计数即可。每隔24小时取3 个孔进行细胞计数。 (5)根据计数所得数据绘制细胞生长曲线。 (三)WST-8细胞活力实验 (1)收集对数生长期的786—0及OS-RC-2细胞,制备细胞悬液、细胞计数,方 法同上。调节细胞悬液浓度为4104ml。 (2)每孔中加入50 u1细胞悬液(即2000个细胞/孔),然后各孔加入含有设计 值2倍浓度药物的完全培养基50 u1,混匀,这样使药物终浓度恰好为设计值, 且保证了各孔细胞数的一致性。每个条件设置5个复孔。 (3)将细胞置于5%C02、37条件下的细胞培养箱中孵育。 (4)分别在24小时和48小时后终止培养,吸取孔内培养基,更换新鲜完全培 养基,每孔加入10 l-t 1WST-8溶液,用加了新鲜完全培养基和WST一1溶液但没有 接种细胞的孔作为空白对照。 (5)避光条件下置于摇床5分钟摇匀,后继续放入37。C、5%C02条件下培养箱 中培养1小时。 (6)酶标仪下测定450nm吸光度值。 (7)细胞活性抑制率=(对照组吸光度值一实验组吸光度值)/(对照组吸光度值 /空白组吸光度值)100%。 山东大学硕士学位论文 (四)划痕细胞迁移实验 (1)准备无菌6孔细胞培养板,marker笔在6孔板背面每隔lcm划一道标记线。 (2)取对数生长期细胞,PBS液洗涤2次,0.25%胰蛋白酶消化、吹散,将细 胞悬液离心,更换完全培养基重悬。接种于标记好的6孔培养板中培养,每孔加 510。细胞。 (3)37。C、5C0:培养,待倒置相差显微镜下观察各孔细胞密度约达到90%时吸 取完全培养基,换用无血清培养基培养24小时,以消除由于血清引起的增殖对 迁移作用的干扰。 (6)无血清培养到指定时间后用高压消毒的200 uL枪头垂直6孔板上的标记线 划痕。划痕与孔板上mark笔上的横线交叉点即为观察的固定点。 (6)PBS清洗2次洗去划下的细胞。更换新鲜的无血清培养基,按照实验条件 在各组培养基中加入相应浓度的药物,同时设立对照组,置37。C、5%C0。孵箱 中培养。 (6)每个孔取8个固定点观察划痕后12h、18h的细胞迁移情况并照相,使用 ImageJ图像分析软件测定每张图片划痕区的面积。 (6)迁移率=(观察时间固定点划痕面积一起始时间固定点划痕面积)/起始时间 固定点划痕面积100%。迁移抑制率=(实验组迁移率一对照组迁移率)/实验组 迁移率100% (五)TranswelI细胞侵袭实验 (1)取培养在完全培养基中的对数生长期786-0和OS-RC一2肾癌细胞株,PBS 洗涤2次,换用无血清的RPMI-1640培养基培养12小时,以减少细胞增殖对侵 袭实验的影响。 (2)准备Transwell小室。小室可搭置于24孔细胞培养板上,底面为直径6.5mm、 孔径8 um的膜。取40 u1以l:5稀释的lmg/ml基质胶铺在上室,并放入4。C过 夜风干,该操作需在冰上完成,因基质胶在室温下易迅速凝固。 (3)786—0和OS-RC-2肾癌细胞株经无血清RPMI-1640培养基培养到12小时后, 胰酶-EDTA消化、离心后吸去上清,加入无血清的RPMI-1640培养基重悬,细胞 计数调整细胞浓度至l X106/ml。 (4)将准备好的带有Transwell小室的24孔板取出,下室(即24孔板的孔) 14 山东大学硕士学位论文 中加入500 pl含有10%胎牛血清的完全培养基,以提供对细胞的趋化作用。将 上室搭在孔上,此时可见上室底面的膜刚好浸在了下室中的培养基里。观察下室 的培养基与上室底面的膜之间没有气泡即可。 (5)取50 u1细胞悬液加在各个孔的上室,再加入含有不同浓度药物的无血清 RPMI一1640培养基50 u1,使各个孔上室药物的浓度达到实验设计浓度。观察各 孔中没有气泡。 (6)将细胞放入37"C、5C02的恒温培养箱中培养12小时,取出上室。用棉棒 轻柔擦拭小室膜的上面,将没有穿过膜的细胞擦掉。 (7)将小室用PBS轻柔冲洗,洗去表面的培养基。 (8)将小室放入95%乙醇中固定10分钟。 (9)用PBS轻柔冲洗小室表面的固定液,再将小室放入苏木素中染色5分钟。 (10)小室放入1%盐酸酒精中分化,自来水冲洗返蓝5分钟。 (11)将小室放入伊红中染色5分钟,然后自来水冲洗。 (12)小室依次放入75%乙醇1分钟、85%乙醇1中分钟、95%乙醇1中分钟、100% 乙醇4分钟。 (13)将小室风干,用刀片小心沿边缘切下小室底面的膜。膜底面朝上放在盖玻 片上,中性树胶封片。 (14)在正置显微镜下观察,每张片在200X下取8个随机视野,数出每个视野 中穿过的细胞数,进行统计分析。 (六)酶活性底物法测定CDl3/A刚活性 (1)取对数生长期786-0和OS-RC-2肾癌细胞株,PBS洗涤2次,消化、离心, 用完全培养基重悬。细胞计数调整细胞浓度为1105/ml,接种到96孔板中,每 孔100u 1。放入37"C、5C0。的恒温培养箱中培养12小时。 (2)12小时后观察细胞贴壁,吸去培养基,在各孔加入含有设计药物浓度的无 血清RPMI一1640培养基200u 1,每组设定5个复孔,培养24小时。 (3)吸去上清,PBS清洗2遍,各孔中加入lmmol/L的L一亮氨酸一P硝基苯胺120 u1,37"C、5C0:避光孵育60分钟。 (4)将各孔的上清液100 ul,移入一个新的96孔板中,以lmmol/L的L一亮氨 酸一P硝基苯胺100 ul为调零孔,测定405nm处的吸光度值。 山东大学硕士学位论文 (5)氨肽酶活性率=(实验组吸光度值一空白组吸光度值)/(对照组吸光度值一 空白组吸光度值)100%。 (七)Western Blot测定肾癌细胞株、肾癌组织蛋白表达 (1)细胞蛋白提取 A.细胞处理:取对数生长期细胞,胰酶消化、离心、重悬后细胞计数,等量接 种在lOcm培养皿中以完全培养基培养。待细胞密度达到70-80%换用无血清 RPM[1640培养基培养12小时,加入实验设计的不同浓度的药物,继续培养12 小时。 B.到达预定作用时间后,取出培养皿,吸出培养基。以4"C预冷PBS冲洗3次, 每次2分钟,控干水分。 C.加入裂解液200 ul,冰上静置30分钟。用细胞刮刮下细胞,转移到1.5mlEP 管中,震荡混匀,4离心机离心15000转/分共30分钟。 D.将离心后的上清吸入新的1.5mlEP管中,吸出3u 1加入57u 1蒸馏水中备用 测蛋白浓度,剩余上清液按上清液:上样缓冲液4:1的比例加入5上样缓冲液。 震荡混匀后在99金属浴变性10分钟,放入-80低温冰箱保存。 (2)组织蛋白提取: A.组织处理:将手术中取得新鲜病理标本切成直径约0.5cm小块,投入液氮中 约5秒钟使其变硬。将研钵中放入液氮,将变硬的组织块研碎,期间保持研钵中 一直有液氮,防止组织粘在研钵的内壁。 B.组织充分磨成粉末状后收集到1.5mlEP管中,加入4"C预冷并含0.I%PMSF的 PBS,震荡混匀,慢速离心3分钟。观察上清颜色如仍有淡红色,需吸出上清再 次加入PBS重复离心过程,直至离心后上清液呈无色透明,以消除血红蛋白对定 量的影响。 C.吸出PBS,加入含I%PMSF的RIPA蛋白裂解液,震荡混匀,冰上裂解30分钟。 D.4、15000转/分离心30分钟。 E.将离心后的上清吸入新的1.5mlEP管中,吸出3IJ 1加入57u 1蒸馏水中备用 测蛋白浓度,剩余上清液按上清液:上样缓冲液4:l的比例加入5上样缓冲液。 震荡混匀后在99"C金属浴变性10分钟,放入-80'ct氐温冰箱保存。 (3)蛋白浓度测定: 16

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医学/心理学 --  肿瘤学
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