3D打印丝素蛋白-胶原支架与ADSCs构建组织工程脂肪的实验研究

3D打印丝素蛋白-胶原支架与ADSCs 构建组织工程脂肪的 实验研究 目的:对3D打印法制备的丝素蛋白-胶原支架的孔径、孔隙率、吸水溶胀率、 力学性能、生物相容性、降解性进行表征,对比3D 打印与冷冻干燥法制备的支 架的区别;观察3D 打印支架与ADSCs 在体内能否成功构建组织工程脂肪。 方法:1.3D 打印与冷冻干燥法(FD)制备丝素蛋白-胶原支架,其丝素蛋 白浓度为3.9%,胶原浓度为1.95%,二者混合比例为2:1。艾尔棋牌_[官网入口]2.大体观察由丝素蛋 白-胶原制备的3D 打印支架(实验组)和FD 支架(对照组)的外观,分别测量 两组支架的孔隙率、吸水溶胀率、孔径、力学性能;分离提取脂肪间充质干细胞 (ADSCs),将第3 代ADSCs 分别接种在两种支架材料上体外培养,使用CCK-8 试剂检测细胞在450nm 波长处OD 值,即支架对细胞的毒性及与细胞的生物相 容性,并在培养14 天后,对细胞-支架复合物进行固定制样,扫描电镜观察细胞 在两组支架材料上的黏附及伸展状态及细胞是否分泌基质。3.将两组ADSCs-支 架复合物培养后植入大鼠皮下,于植入后2w、4w、6w 观察支架变化,了解两 组支架降解情况。并取植入材料做HE 染色、Masson 染色、免疫组织化学染色, 了解炎症反应、纤维化程度及成脂情况。 结果:1.大体观察:3D 支架大体白色,呈网格状,内部结构规则,厚薄一 致,表面孔隙规律整齐分布,孔径大小基本一致,湿态下质软,有一定弹性;扫 描电镜见3D 支架中细胞可充分粘附伸展,伸出伪足,并分泌大量细胞外基质。 FD 支架大体白色,呈致密片状结构,较规则,厚薄不一,表面略凹凸,见泡状 结构,支架内部有大小不一的孔径,排列杂乱,连通性差。质韧,不易变形;扫 描电镜见FD 支架中细胞可充分粘附伸展,伸出伪足,并分泌大量细胞外基质。艾尔棋牌_[官网入口] 2.使用SPSS 21.0 统计软件对数据进行分析,符合正态分布和方差齐性,两组间 比较差异性采用独立样本t 检验,以P<0.05 作为判断差别显著性的标准。3D 印支架的孔径为(226.0628.40)μm,FD支架的孔径为(186.9133.93)μm, 两组间孔径比较差异无显著性意义(P=0.619);3D 打印支架的孔隙率为(94.01 6.08)%,FD 支架的孔隙率为(80.372.72)%,两组间孔隙率比较差异有显著 性意义(P=0.024);3D 打印支架的吸水溶胀率为(301.6330.03)%,FD 支架的 吸水溶胀率为(208.3345.37)%,两组间吸水溶胀率比较差异有显著性意 万方数据 II (P=0.041);3D 打印支架的弹性模量为(34.6613.74)kPa,FD 支架的弹性模量 为(32.8712.43)kPa,两组间弹性模量比较差异无显著性意义(P=0.836)。3. 用CCK-8 试剂检测ADSCs-支架共培养后在450nm 波长处的OD 值,结果显示, 随着培养天数的增加,OD 值逐渐升高,3D 组支架OD 值略高于FD 组,说明 3D 组支架上的细胞数目多于 FD 组,但两组间细胞相容性比较无显著性意义 (P=0.061)。艾尔棋牌_[官网入口]4.ADSCs-支架共培养后扫描电镜观察:见两组支架中细胞均可充 分粘附伸展,伸出伪足,并分泌大量细胞外基质。5.于2w,4w,6w 各时间点 大体观察支架:两组支架均被一层包膜覆盖,3D 组包膜较FD 组为厚,包膜表 面有新生血管形成,见包膜下薄层脂肪,随时间变化支架逐渐变小。组织学观察 见3D 组与FD 组均有炎细胞浸润,多核巨细胞形成,见残损支架材料,纤维膜 下有脂肪细胞,纤维大量增生,随时间推移炎症反应渐减轻,3D 组炎症反应及 纤维化程度较FD 组为轻;行免疫组织化学染色:两组均可见胞膜呈特异性棕黑 色的空泡状脂肪细胞。 结论:1.通过研究发现,3D 打印的支架材料孔径适宜,孔隙率、吸水溶胀 率、空间结构优于FD 支架,利于细胞粘附、增殖,与细胞生物相容性良好。2.3D 打印支架体内可降解,且降解性能良好。3.3D 打印支架体内炎症反应及纤维化 程度轻,在体内可形成脂肪组织,适宜于脂肪组织工程的研究。 关键词:3D 打印,冷冻干燥,丝素蛋白-胶原支架,脂肪间充质干细胞,组 织工程 万方数据 III EXRERIMENTAL STUDY TISSUEENGINEERED FAT 3DPRINTED SILK FIBROIN-COLLAGEN SCAFFOLD ADSCsAbstract Objective:To characterize poresize, porosity, water swelling rate, mechanical properties, biocompatibility silkfibroin-collagen scaffolds prepared 3Dprinting, differencebetween 3D printing scaffoldprepared freeze-dryingmethod. Observe whether 3D printing scaffolds ADSCscan successfully construct tissue engineering fat vivo.Methods:1.Silk fibroin-collagen scaffolds were prepared 3Dprinting freeze-drying(FD). silkfibroin concentration collagenconcentration mixingratio 2:1.2.Generally observed 3Dprinting scaffold (experimental group) FDscaffold (control group) prepared silkfibroin-collagen were.The porosity,water swelling rate, pore size mechanicalproperties twogroups scaffoldswere measured respectively; isolate adipose-derivedmesenchymal stem cells (ADSCs). thirdgeneration ADSCs were inoculated twokinds scaffoldmaterial separately CCK-8reagent detect ODvalues 450nmwavelength after14 days cell-scaffoldcomplex scaffoldmaterials matrixwere observed scanningelectron microscopy.3. twogroups ADSCs-scaffoldcomplexes were cultured ratsubcutaneous. scaffoldswere observed 2w,4w 6wafter implantation, understanding twogroups implantmaterials were taken HEstaining, Masson staining, immunohistochemicalstaining inflammatoryresponse, degree 万方数据IV fibrosis adipogenesis.Results: Generalobservation: 3D scaffold generallywhite, grid-like, internal structure regular,thickness uniform,surface pores regularlydistributed, pore size same,soft under wet conditions, certain elasticity; scanning electron microscopy shows 3Dscaffold can fully adhere stretch,protrude from largeamount extracellularmatrix. FDscaffold generallywhite densesheet-like structure. relativelyregular hasdifferent thickness. slightlyconcave convex.See bubblestructure. scaffoldhas different sizes holes,disordered arrangement poorconnectivity. deform.Scanning electron microscopy shows FDscaffold can fully adhere stretch,protrude from largeamount extracellularmatrix. datawere analyzed SPSS21.0 statistical software, which accorded normaldistribution differencebetween twogroups independentsample differencesignificance. 3Dprinting scaffold FDscaffold significantdifference poresize between twogroups (P=0.619); 3Dprinting scaffold FDscaffold (80.372.72)%, significantdifference porositybetween twogroups (P=0.024); waterswelling ratio 3Dprintingscaffold waterswelling rate FDscaffold significantdifference waterswelling between twogroups (P=0.041). elasticmodulus 3Dprinting scaffold (34.6613.74)kPa. elasticmodulus FDscaffold (32.8712.43) kPa, significantdifference elasticmodulus between twogroups (P=0.836). 3.The CCK-8 reagent ODvalue 450nm after co-culture ADSCs-scaffolds.Theresults showed ODvalue increased gradually culturedays, ODvalue 3Dgroup slightlyhigher than FDgroup. 3Dscaffold higherthan FDgroup, significantdifference cellcompatibility between twogroups (P=0.061). Scanningelectron microscopic observation ADSCs-scaffoldafter co-culture: See bothgroups scaffoldcan fully adhere stretch,extend largenumber 万方数据 extracellularmatrix. 2w,4w, 6w everytime points: both groups scaffoldwere covered envelopewhich 3Dgroup thickerthan FDgroup,and newblood vessels formed thinlayer fatunder scaffoldgradually becomes smaller timegoes Histologicalobservation showed 3Dgroup FDgroup had inflammatory cell infiltration, multinucleated giant cells formed, see damaged scaffold materials, werefat cells under fibrousmembrane, fibersproliferated greatly. inflammatoryreaction graduallyreduced over time, 3Dgroup inflammatory reaction lighterthan FDgroup;Immunohistochemical staining:vacuolar adipocytes specificbrown-black color were observed bothgroups. Conclusions: Throughresearch, 3Dprinting scaffold has suitable pore size, porosity, water swelling ratio spatialstructure superior FDscaffold, which celladhesion hasgood biocompatibility 3Dprinting scaffold hasgood degradation performance. 3.The 3D printing scaffold has mildinflammation canform adipose tissue body,which adiposetissue engineering. Key words: 3D printing,freeze-drying,silk fibroin-collagen scaffold,adipose-derived mesenchymal stem cells, tissue engineering 万方数据 VI 英文缩写英文全称 中文全称 TE tissue engineering 组织工程 ADSCs adipose-derived stem cells 脂肪间充质干细胞 3D three dimensional 三维的 FD freeze drying 冷冻干燥 CCK-8 cell counting kit-8 细胞计数试剂盒 ECM extracellular matrix 细胞外基质 PBS Phosphate buffered saline 磷酸盐缓冲溶液 DMEM Dulbecco’s Modified Eagle Media 达尔伯克改良伊格尔培 ODoptical density 吸光度 HE hematoxylin-eosin 苏木精-伊红 EDTA Ethylene Diamine Tetraacetic Acid 乙二胺四乙酸 FBS Fetal Bovine Serum 胎牛血清 GF Gas foaming 气体发泡法 PGA polyglycolic acid 聚乙醇酸 PLGA polylactic-co-glycolic acid 聚乳酸羟基乙酸 AM additive manufacturing 增材制造 SEF solid free-form technology 实体自由制造 万方数据 第一部分3D 打印支架与冷冻干燥支架的制备及性能检测................... 1.1材料........................................................................................................ 1.2试剂及仪器............................................................................................ 2.1ADSCs 的分离提取与培养.................................................................4 2.2 复合支架的制备..................................................................................... 2.3复合支架材料的性能检测方法............................................................. 2.3.1复合支架材料的大体外观及扫描电镜观察................................. 2.3.2复合支架材料孔径的测定............................................................ 2.3.3复合支架材料孔隙率的测定........................................................ 2.3.4复合支架材料吸水溶胀率的测定................................................ 2.3.5复合支架材料力学性能的测定.................................................... 2.3.6复合支架材料生物相容性的测定................................................ 2.3.7统计学分析.................................................................................... 3.1ADSCs 倒置相差显微镜下观察...............................................................6 3.2 复合支架材料的大体外观及扫描电镜观察............................................ 3.3复合支架材料的孔径................................................................................ 万方数据3.4 复合支架材料的孔隙率............................................................................ 3.5复合支架材料的吸水溶胀率.................................................................... 3.6复合支架材料的力学性能........................................................................ 3.7复合支架材料的生物相容性.................................................................... 第二部分ADSCs-复合支架材料共培养后体内降解性的观察及成脂 情况的研究 101.材料.................................................................................................................. 10 2.方法.................................................................................................................. 10 2.1 复合支架材料的处理及ADSCs 的接种.................................................10 2.2 ADSCs-支架复合物大鼠体内的植入.................................................... 11 2.3 ADSCs-支架复合物植入后外观大体观察............................................ 11 2.4 ADSCs-支架复合物体内降解性观察.................................................... 11 2.5 ADSCs-支架复合物HE 染色................................................................. 11 2.6 ADSCs-支架复合物Masson 染色.......................................................... 11 2.7 ADSCs-支架复合物免疫组织化学染色................................................ 12 2.8 统计学分析............................................................................................... 12 结果................................................................................................................12 3.1 体内植入ADSCs-支架复合物后外观及降解性大体观察................... 12 3.2 ADSCs-支架复合物HE 染色................................................................. 12 3.3 ADSCs-支架复合物Masson 染色.......................................................... 13 3.4 ADSCs-支架复合物免疫组织化学染色................................................ 13 讨论................................................................................................................13 主要结论 15参考文献 16在学期间的研究成果 19万方数据 致谢 20综述 21附图 31万方数据 兰州大学硕士学位论文 3D 打印丝素蛋白-胶原支架与ADSCs 构建组织工程脂肪的实验研究 组织工程是通过工程技术与生命科学的原理和方法制备出组织替代物,改善和修复组织缺损或恢复功能的新技术 ,与它相关的领域包括分子材料学、生物学、临床医学、工程制造等多个学科 ,在医学领域研究最多的是工程化骨与软骨组织。其方法是将有生物活性的细胞接种于3D 打印支架上,在某种信号因子 的参与下,体外构建目标组织或器官,培养一定时间后,将它们植入体内逐渐修 复缺损组织或器官,关键是构建由目的细胞与支架材料组成的三维复合物 织工程有三大要素,包括种子细胞、支架材料、信号因子,其中种子细胞是基本要素,多选择成体细胞和间充质干细胞;信号因子具备良好的生物活性,可促进 细胞增殖分化;支架材料的选择是组织器官重建的重点 ,它可模拟细胞外基质(ECM),为细胞提供基本的生长环境。 随着近年来组织工程的发展,其涉及的组织类型也不断增加,包括骨与软骨 组织工程,脂肪组织工程,神经组织工程,真皮组织工程,血管组织工程等。而 由于外伤、先天性畸形、病损切除导致的软组织缺损,多需行手术修复,其常用 方法有皮瓣、肌皮瓣移植、人工合成替代物的植入,但当前还没有一种填充材料 可以满足临床及患者需求。利用自体脂肪组织移植(游离移植或真皮脂肪瓣移植) 修复软组织缺损已有较长历史,临床应用中也有不少报道,但游离移植后脂肪细 胞成活率低、容易吸收,真皮脂肪瓣移植操作复杂、不易塑形,治疗效果并非十 分理想 。因此,应用组织工程学原理来构建脂肪组织已成为组织工程研究领域的热点之一。 脂肪组织工程旨在把目的细胞接种于支架材料上,在适宜的生长环境及信号 因子的作用下,逐渐形成成熟脂肪组织。支架材料充分模拟了ECM 环境,为种子 细胞提供了适宜其生长、粘附、分化、繁殖的生物学三维空间,还能促进目的细 胞合成新的细胞外基质成分,增强细胞代谢活性 。成功构建组织工程化脂肪的方案,需要包括以下几个方面:一是目的细胞的获取(多为ADSCs);二是要有 能够调控种子细胞生长和分化的各类细胞因子;三是支架材料的选择。艾尔棋牌_[官网入口] 提供机械支撑的支架材料应具有以下特性:较好的生物相容性,它有助于 细胞粘附、维持细胞的适当功能和细胞在支架上的生长增殖 。适中的生物降解性,此类材料可被身体周围组织吸收,避免了手术切除支架的需要 。可降解材料具备两个条件: 一是合适的体内降解速率,即降解速度与组织生长速度相匹 配;二是降解后产物在体内代谢完全,无毒无害。具有促进组织再生的能力, 这样可以增强组织的修复能力,加快组织愈合。具有相当的机械强度与变形能 万方数据 兰州大学硕士学位论文 3D 打印丝素蛋白-胶原支架与ADSCs 构建组织工程脂肪的实验研究 力。无毒性及无免疫原性。支架本身及其产物应无毒、无害,不引起机体免疫反应 。适宜的孔径利于细胞附着生长,也有助于血管化。理想情况下,90%的孔隙率和100-500μm 的孔径是合适的 。来源广,易获取,成本低。目前常用的支架材料有丝素蛋白、胶原蛋白、透明质酸、壳聚糖、明胶等, 本实验选取的丝素蛋白 [10] 是从蚕丝中提取的高分子纤维蛋白,它来源丰富,有 良好的生物相容性、柔韧性、透气性和机械性 [11] ,抗微生物,可缓慢生物降解, 可加工成多种形式,且吸湿、保湿。另有研究发现,在丝素蛋白支架上接种的 ADSCs 贴壁良好,增殖活跃,约14 天细胞便可充满支架孔隙,扫描电镜见基质 分泌。表明丝素对ADSCs 有良好吸附作用,可维持ADSCs 的正常形态和功能 丝素蛋白性质可通过调节β-折叠含量而提高机械强度、减缓降解速率、保持结构特征 [12] 。由于它来源广、易获取,再加上良好的细胞粘附性及韧性,成为了组织 工程的常选材料,也常用于复合支架研究。而胶原是研究最多的材料之一,由成 纤维细胞产生并广泛存在人体结缔组织中,是细胞的框架结构 [13] 。有28 均由3条α链组成三螺旋结构 [14] 。其降解产物毒性小 [15] ,生物相容性、机械剪切 力、交联性能良好,抗原性低,较少引起炎症和细胞毒性反应,获取方法多 但吸水后机械和结构稳定性差,机械拉伸力逐渐降低,可引起疾病传播或过敏反应。通过对胶原表面改性或改变浓度 [16] ,或混合其他天然及合成聚合物,可改善 机械强度、渗透率、压缩模量及抗张强度 [14] ;也可添加不同交联剂改变降解速度, 增强力学性能 [15] ;且Willard [17] 等人发现从植物中提取胶原可降低疾病传播风险 及过敏反应。胶原还可参与组织修复,已逐渐在烧伤、美容领域中得到应用,胶 原的不同性能表现出对不同组织的适用性,使其得到了广泛应用。 目前常用的组织工程支架构建方法有:粒子析出法、气体发泡法、烧结法、 冷冻干燥法、3D 打印 [18] 。鉴于3D 打印技术迅速发展,利用该技术制备支架成 为可能。它是通过计算机辅助设计软件及3D 打印机将塑料、金属、陶瓷、粉末、 液体、活体细胞层转化为三维实体 [19] ,3D 打印可以克服传统支架制造方法在形 态和工艺一致性方面的限制;另外,3D 打印支架在生物性能方面也有很大改善 [18] 。该方法制备的支架孔径、孔隙率、空间结构可能更符合组织要求,成为研究 热潮。 本研究通过使用3D 打印方法制备三维多孔的丝素蛋白-胶原支架,了解该方 法制备的支架的孔径、孔隙率、吸水溶胀率、力学性能及生物相容性,并通过动 物体内实验检测支架降解性能及体内成脂情况,了解3D 打印支架与传统方法制 备的支架在脂肪组织工程应用上的区别。 万方数据 兰州大学硕士学位论文 3D 打印丝素蛋白-胶原支架与ADSCs 构建组织工程脂肪的实验研究 第一部分3D打印与冷冻干燥复合支架的制备及性能检测 随着组织工程的不断发展,组织工程支架的制备方法也在不断改进,从传统 的冷冻干燥、相分离、气体发泡、溶剂浇铸/粒子沥滤法、颗粒烧结等,到现在 的增材制造、静电纺丝、自组装肽等方法,使得组织工程支架的构建更趋符合制 备要求 [18] 3D打印又称增材制造、实体自由制造,是通过计算机辅助设计(CAD)软件 及3D 打印机将作为原料的塑料、金属、陶瓷、粉末、液体、活体细胞层转化为 三维实体 [19] 。目前已广泛用于组织工程支架的制备,它可以克服传统支架制造方 法在形态和工艺一致性方面的限制 [20] 。另外,3D 打印支架在生物学性能方面也 有了很大改善。一般来说,提供机械支撑的支架需具备较好的生物相容性

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