红细胞对创伤性脑出血大鼠脑含水量与TNF-α表达的影响

红细胞对创伤性脑出血大鼠脑含水量与TNF-α 表达的影响 1)河南科技大学第一附属医院神经外科洛阳4710032)中南大学湘雅医院神经外 科长沙410078 #通讯作者,男,65 岁,博士生导师,教授,研究方向:垂体腺瘤的显微外科治疗,脑水肿 的基础研究,E?mail:xyliuys@163.corn 关键词脑内出血;创伤;脑水肿;红细胞;肿瘤坏死因子;大鼠 中图分类号R651.15 摘要目的:观察创伤性脑内出血(TICH)模型中红细胞对脑含水量和TNF-ot 表达的 影响,探讨红细胞在 TICH后脑水肿形成中的作用机制.方法:120 只大鼠随机分为创伤性脑损伤组(TBI 组),TBI 加注全血组(WB 组),TBI 加注溶解红细胞组(LRBC组)和TBI 加注压积红细胞组(PRBC组),每组30 组均采用自由落体打击法造成大鼠脑外伤.后3 组借助立体定向仪分别向伤区脑皮质内注射全血,溶解 红细胞和压积红细胞,造成 TICH 模型.于伤后 1d,3d,5d 分别处死 10 只大鼠,5 只用于测伤区脑组织含水量,5 只用于免疫组化法检测TNF? 的表达.结果:伤后不同时点比较:TBI,WB 3d的脑含水量最 高,LRBC 组第1d 的含水量最高;4 组间比较:1d 时LRBC 含水量最高,3d 时PRBC 和WB 组含水量均高于另2 WB,PRBC和LRBC 组,TNF-ot 的阳性表达与脑含水量的变化相一致.结论:红细胞可使 TICH 大鼠的脑含水量增 加,TNF—ot 表达增强,且2 变化趋势一致,提示红细胞在TICH 后迟发性脑水肿的形成中有重要作用,其机制 与炎症反应关系密切. EffectoferythrocyteonbrainwatercontentandexpressionofTNF.t)【in ratswithtraumaticintracerebralhemorrhage SH/Baozhong. FANBo,MENGXiaofeng",LIUJinfang,XULixin,LIUYunsheng. )DepartmentofNeurosurgery,theFirstAffiliatedHospital,HenanScience&Technolo gyUniversity, Luoyang4710032)DepartmentofNeurosurgery,XiangyaHospital,CentralSouthUniversi ty,Chang- sha410078 Keywordsintracerebralhemo~hage;trauma;brainedema;erythrocyte;tumornecrosisfacto r;rat AbstractAim:Toexploremechanismsoferythroeyteinbrainedemadevelopmentaftertraum aticintraeerebralhem? orrhage(TICH)bystudyingeffectoferythrocyteonbrainwatercontentandexpressionofTN F-otinratswithTICH.Moth- ods:Atotalof120SDratswereallocatedintotraumaticbraininjury(TBI)group,TBIpluswho leblood(WB)group (WBgroup),TBIpluslysedRBC(LRBC)group,andTBIplusparkedRBC(PRBC)group,30 ratsineachgroup. Firstly,theTBImodelofratswasestablishedbyapplyingafree?fallingdevicein4groups,then WB,LRBC,andPRBC wereinfusedintoinjuriedcortextoproducemodelofTICH.Tenratswerekilledonthe1st,3rda nd5thdayafterinjury. Thebrainwatercontentoftheinjuredareawasmeasured,andtheexpressionofTNF-otwasdet ectedusingimmunohisto- chemistry.Results:ThebrainwatercontentinWBgroup,PRBCgroupandTBIgroupwasthe higheatonthe3rdday, whichwasthehighestinLRBCgrouponthe1stday.Amongthe4groups,watercontentinLRB Cgroupwasthehigheston the1stday,andthatinWBandPRBCgroupswerethehighestonthe3rdday,andtherewasnosig nificantdifferencea- mongthemonthe5thday.ThepositiveexpressionofTNF?wascoincidentwithvarietyofbrai nwatercontentinWB.PRBC andLRBCgroups.Conclusion:Erythroeytemayincreasebrainwatercontentandenhanceex pressionofTNF-otinratswith TICH,andvarietyofbrainwatercontentiscoincidentwiththeexpressionofTNF-ot.Itissugg estedthaterythrocyteplaysan importantroleindelayedbrainedemafollowingTICH,andthemechanismmayinvolveininfl ammationreaction. 脑内出血(intracerebralhemorrhage,ICH)主要 博士研究生课题 包括创伤性脑内出血(traumaticICH,TICH)和自发 性脑内出血(spontaneousICH,SICH)….临床常见 血肿周围有明显脑水肿,它是ICH 病情加重,恶化 JournalofZhengzhouUniversity(MedicalSciences)May2007Vo1.42No.3 的一个重要原因,但其产生机制不明.许多研究 表明血肿释放的某些物质或血液成分与脑水肿的产 生关系密切.但这些研究主要是针对SICH.近 来有研究显示,血肿内的红细胞可使肿瘤坏死因子 (tumornecrosisfactor—Ot,TNF—Ot)处于应激状态,损 害血脑屏障,加重脑水肿.作者在大鼠局灶性脑 挫裂伤的基础上,向伤灶局部分别注射全血(whole blood,WB),溶解红细胞(1ysedredbloodcell,LR— BC),压积红细胞(packedredbloodcell,PRBC)制 作TICH 动物模型,观察不同状态红细胞对TICH 鼠脑含水量和TNF—Ot表达的影响,初步探讨红细胞 在TICH 后脑水肿形成中的作用. 材料与方法1.1 动物来源,主要试剂与仪器健康成年SD 鼠120只,清洁级,雌雄不拘,体质量210~300g,由 中南大学湘雅医学院实验动物学部提供.兔抗 TNF—Ot 抗体,SABC 免疫组化试剂盒,多聚甲醛,PBS 均购自武汉博士德生物工程有限公司;鼠脑立体定 向仪(STOELTINGTL 型,美国),电子分析天平(AB104 型,瑞士METTLERTOLEDO 公司),HPIAS 1000高清晰度彩色病理图像分析系统(HPIAS 一1000 型,同济医科大学). 1.2 动物分组120 只大鼠随机分成创伤性脑损 伤(traumaticbraini.jury,TBI)组(对照组),TBI 注全血组(WB组),TBI 加注溶解红细胞组(LRBC 组),TBI 加注压积红细胞组(PRBC 组),每组30 只.20g/L 戊巴比妥钠2ml/kg 腹腔注射麻醉.麻 醉成功后,将大鼠俯卧位固定于操作台上,额顶部剃 毛,消毒,正中矢状切口,长约2cm,右额顶部磨钻 钻孔(以人字缝前,矢状缝右3mm 为中心).形成直 径约5mm 的类圆形骨窗,保持硬膜完整.应用自 由落体打击法制作大鼠局灶性脑挫裂伤模型:将致 伤垫片置于类圆形骨窗上,20g 砝码于距颅骨30 cm 高处释放,呈自由落体打击在垫片上,造成局灶 滴,备注射用.LRBC和PRBC 大鼠于制作骨窗前 取静脉血1mL,按文献[8]分别制备LRBC PRBC,备注射用.制作成功后,迅速将大鼠固定于鼠脑立体定向仪上,微量进样器抽取50LWB LRBC或PRBC,沿骨窗中心进针,深度3mm,注射 15min,注射完毕留针5min 再缓慢拔出.即制成 TICH 模型. 1.3 观察指标各组分别于伤后1d,3d,5d 处死 10 只大鼠.5 只用于检测脑含水量,另5 只用于检 507?测TNF—Ot.含水量测定:大鼠断头处死,完整取出鼠 脑,置于冰盘上,在伤灶区取脑组织块,干湿重法测 定脑组织含水量,脑含水量=(湿重一干重)湿 重1o0%.TNF—Ot 检测:大鼠断头前先经左心室灌 注生理盐水和40g/L 多聚甲醛(pH7.2~7.4),然 后断头取脑.距注射针孔前后各约2mm 冠状切, TBI 组大鼠距额极4mm,8mm 处冠状切,40g/L 聚甲醛保存标本.免疫组化SABC法测TNF—Ot.用 PBS 代替一抗作为阴性对照,胞浆有棕黄色颗粒沉 着为阳性细胞.利用HPIAS 一1000 高清晰度彩色病 理图像分析系统测定阳性细胞的灰度值. 1.4 统计学处理采用SPSS10.0 版统计软件行 重复测量数据的方差分析或日检验.检验水准Ot= 0.05. 结果2.1 大鼠一般情况所有大鼠脑外伤后均有不同 程度的呼吸变浅,变慢,约1min 后好转.WB,LRBC, PRBC 组大鼠在立体定向注射过程中均有烦躁,抽搐. 实验中因麻醉意外死亡2 只大鼠,又补充2 2.2脑组织含水量及TNF-Ot 的表达见表1. 表14 组伤后不同时间 脑组织含水量,TNF-位平均灰度值比较 组别n 含水量/%TNF.0【的灰度值 1d579.691.061O3.116.56 TBI3d582.850.60107.8914.33 5d578.442.O01O3.941O.52 ld580.7O1.6987.9O1.50 WB3d585.OO1.1279.132.O0 5d577.591.93104.8112.63 1d584.440.8576.762.56 LRBC3d582.681.O891.288.19 5d578.531.2l95.811O.32 1d581.720.8l96.015.36 PRBC3d584.931.2172.333.62 5d576.792.0995.697.3O 伤后3d明显高于伤后1d 和5d(P<0.05);LRBC 明显高于伤后3d和5d(P<0.05); TNF-Ot:TBI 相比均无统计学意义(P>0.05);WB,PRBC2 组伤后3dTNF—Ot 度值明显低于伤后Id和5d(P 均<0.01);LRBC 组伤后1dTNF-Ot 的灰度值明显低于伤后3d 和5d 组组问比较,含水量:伤后1d以LRBC 508?最高(P 均<0.01);伤后3d,WB 和PRBC 显高于TBI和LRBC 均<0.01);TNF—d:伤后1d,LRBC 组灰度值最低(P 均<0.01);伤后3 d,WB 和PRBC 组的灰度值均明显低于TBI 和LR- BC 组(P<0.05).伤后5d,4 组间含水量,TNF—d 相比较差异均无统计学意义. 讨论临床常见脑内血肿周围有明显水肿,它的产生包 期:最早期(出血后几h),与流体静力压和血块收缩有关;早期(第1d),与凝血级联反应和凝血酶的 产生有关;第3 期(约在第3d 以后),与红细胞溶解 和血红蛋白的毒性有关].研究删表明,在ICH 中,红细胞及其分解产物对脑水肿的产生有重要作 可引起血肿周围迟发性水肿,LR—BC 则可引起早期血肿周围水肿. 本研究结果显示,单纯脑外伤在不伴有脑内 出血时,脑水肿第3d 达高峰;脑外伤加注WB PRBC后,即脑外伤在伴有脑内出血时,脑水肿高峰 期也是在第3d,但水肿程度较单纯脑外伤明显加 重,提示血液或血液成分可加重TICH 后的脑水肿. WB 组与PRBC 相比,差异无统计学意义,但WB中除红细胞外,尚 有血浆,血浆蛋白,白细胞和血小板等,而PRBC 含红细胞.该结果进一步说明,在TICH后第3d, 血液中的其他成分对脑含水量作用较小,起主要作 用的是红细胞.LRBC 组,PRBC 组脑水肿的高峰 期分别是第1d 和第3d,提示在TICH 早期(第1 d)脑水肿的形成中,LRBC 作用明显,而PRBC 无明 显作用,这与以前的研究'…一致.PRBC 达到高峰,此时的红细胞大部分已是溶解红细胞,因为已有研究表明,红细胞自发的溶血速 度很慢(每d 约1%),但破人脑组织中的红细胞2~ 3d 即已衰老,其溶血速度将大大加快(500~1000 倍)'.总之,在TICH 后迟发性脑水肿的形成 中,红细胞起重要作用. TNF 一仅是重要的炎症细胞因子,在许多中枢神 经系统疾病中均升高,如脑缺血和脑外伤.最 近的研究显示,TNF—的水平与脑外伤的严重程度 有关,还与脑水肿的形成关系密切.本研究结果 显示:单纯脑外伤在不伴有脑内出血时,TNF.d 伤后1d,3d,5d的表达差异无统计学意义;在伴有 脑内出血时,TNF—d 的阳性表达以第3d 最强,提示 血液或血液成分可增强TNF—在脑组织中的表达. LRBC 阳性表达越强.结合脑含水量的实验结果,TNF.阳性表达的强 弱与各组各时相点(除TBI 外)脑含水量的变化相一 致,即脑含水量明显增高的组别,TNF—的阳性表达 也增强(TNF.仅的灰度值降低).这说明TICH 红细胞可使脑含水量增加,并使TNF—在脑组织中的表达增强,其机制与炎症反应关系密切.TNF—d 起脑水肿的机制可能是:增加毛细血管通透性.TNF.d 和明胶酶B 结合可破坏毛细血管基底膜; TNF.d 还能增强脑血管内皮细胞中的一氧化氮毒性, 活化内皮细胞,增加其通透性.破坏血脑屏障. TNF.d 可诱导基质金属蛋白酶的产生,从而增加血脑 屏障的通透性,诱发血管源性脑水肿. 参考文献 [1]SiddiqueMS,GregsonBA,FernandesHM,eta1.Com- parativestudyoftraumaticandspontaneousintracerebral hemorrhage[J].JNeurosurg,2002,96(1):86 [2]YangGY,BetzAL,ChenevertTL,eta1.Experimental intracerebralhemorrhage:relationshipbetweenbrainede- ma,bloodflow,andblood?brainbarrierpermeabilityin rats[J].JNeurosurg,1994,81(1):93 [3]李玲,陈康宁.脑出血后继发脑损伤机制的研究进展 [J].第三军医大学,2005,27(19):1992 [4]XueMZ,DelBigioMR.Intracorticalhemorrhageinjuryin ratsrelatiodshipbetweenbloodfractionsandbraincell death[J].Stroke,2000,31(7):1721 [5]FigueroaBE,KeepRF,BetzAL,eta1.Plasminogenacti? vator8potentiatethrombin—inducedbraininjury[J]. 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GenetypingforHelicobacterpyloriisolatedfrompatientswithchronic gastritisandpepticulcer XUQingdang,DUANGuangcai,ZHANGJunxi,XIYuanlin,ZHANGWeidong DepartmentofEpidemiology,CollegeofPublicHealth,ZhengzhouUniversity,Zhengzhou 450001 KeywordsHelicobacterpylori;genetyping;vacA;cag—PAI;RAPD AbstractAim:TofindamethodofgenetypingforHelicobacterpylori(Hp)andexploretherela tionshipbetween genotypesofHpanddiseases.Methods:ThegenomediversityofHpgenewastestedbyrando mamplifiedpolymorphie DNA(RAPD)technologyandvacA,cagA,cagE,cagTwereamplifiedbypolymerasechainr eaction(PCR).VacAexpres— sionwasdetectedusingHelacellsculturedwithHpextract.Datawereanalyzedbyclustermet hod.Results:Neither chirSuppl,2002,81:249 [11]XiG,WagnerKR,KeepRF,eta1.Roleofbloodclotfor— mationonearlyedemadevelopmentafterexperimentalin— tracerebralhemorrhage[J].Stroke,1998,29(12):2580 [12]PetersonJW,KwunBD,TeramuraA,eta1.Immunologi— calreactionagainstthehumansubarachnoiderythroeyte [J].JNeurosurg,1989,71(5Pt1):718 [13]XiG,HuaY,KeepRF,eta1.Systemiccomplementde— pletiondiminishesperihematomalbrainedemainrats[J]. 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红细胞对创伤性脑出血大鼠脑含水量与TNF-α表达的影响出血,大鼠,和,创伤性脑,红细胞对,TNFα,大鼠脑,含水量,脑出血,脑损伤

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